.
 工作时间
周一至周日 :8:00-18:00
 联系方式
电话:0818-3322120
电话:0818-3333120
手机:13183511234          13330821810
地址:达州市朝阳中路316号
在线客服
 工作时间
周一至周日 :0:00-23:30
 联系方式
电话:0818-3322120
电话:0818-3333120
手机:13183511234
地址:达州市朝阳中路307号

PCR替代技术,RPA全攻略之引物设计

  重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA),被称为是可以替代PCR的核酸检测技术(由英国公司TwistDx Inc开发)。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品,能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低,特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

  RPA的扩增引物可以说是整个反应的关键所在,那么怎样才能设计好RPA引物呢?

  引物长度的选择

  RPA引物的长度一般为30至35个核苷酸,引物过短会严重影响重组酶的活性。长引物实际上是可以使用的,比如45个核苷酸的引物就曾成功用于RPA扩增。不过,长引物并不一定能提高扩增性能,反而还会增加形成二级结构的可能性,增大来自引物的噪音。为此,TwistDx公司建议大家不要设计过长的引物。

  引物的序列要求

  RPA引物还没有一个确定的序列设计规则,不过这里有一些现成的经验可供参考:

  5’端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤,胞嘧啶在这里是有益的,能促进片段的重组。对于3’末端的3个核苷酸来说,鸟嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的稳定结合,可以提升引物的扩增性能。引物中最好不要出现特殊序列,比如长串的聚嘌呤或聚嘧啶。GC含量过高(>70%)或过低(<30%)都不利于RPA扩增。此外,引物设计时应当尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列,减少引物二聚体的形成。

  扩增产物的长度限制

  RPA可以扩增长达1.5kb的DNA产物,不过这取决于反应的条件。标准TwistAmp试剂盒针对反应速度进行了优化,目前只适合扩增不超过500bp的扩增子,对100-200bp的扩增子效果最佳。RPA扩增产物的下限主要由RPA引物所决定,通常扩增产物要超过70-80bp。

  如果需要用到检测探针,那么在设计扩增引物时应该留下足够的空间。

  引物筛选的主要流程

  目前我们还不能仅根据序列判断引物的扩增性能,因此需要对候选引物进行测试和筛选。RPA的引物筛选主要分为以下几步:选择靶标区域,设计候选引物,筛选候选引物,提升性能再次筛选。

  需要注意的是,靶标区域应选择核苷酸组成相对“平均”的模板序列。GC含量最好在40%到60%之间,不含长串的聚嘌呤或聚嘧啶,尽量不含正/反向重复和回文序列等等。靶标区域最好避开基因组中的重复元件。